為什麼這篇Colony PCR鄉民發文收入到精華區：因為在Colony PCR這個討論話題中，有許多相關的文章在討論，這篇最有參考價值！作者ad1980 (DREAMCHASER)看板Biotech標題[問題] about colony...
最近在做 colony pcr 想直接看有沒有 insert 成功，
可是抓了十個 colonies 沒有一個有。
我的做法是先調好 master mix，然後分到 pcr tube。之後 pick a colony，先在 LB plate 點一下，
再在 pcr mix 裡攪一攪。
program:
1. 94C -- 5 mins (x1)
2. 94C -- 30 sec (x34)
55C -- 1 min
72C -- 1min
3. 72C -- 5 min (x1)
我想問一下，除了說是真的沒有 insert 之外，
有沒有其他 doesn't work 的原因？
我用這個方法之前，做colony pcr的時候是
先把cells放在水裡boil at 99.5C for 5 mins,
spin down, take 3ul for pcr.
這樣做的時候，就沒有問題。
可是我這次直接把 cells 攪在 pcr mix
然後直接 pcr 卻一個insert都找不出來，
這兩種方法我上網查都有人用，應該都可行，
可是我不知道為什麼我直接放cells的時候卻不行。
我第一次做的時候，十個有一個有band，
第二次做的時候，把第一次有band的那個拿來當 +ve control，
結果反而沒有band，但是其他選的六個colonies有一個有band。
所以我想問，兩種方法會有差嘛？
除了是真的沒 insert，其他有可能的問題是什麼？
謝謝，感激不盡。
--
絕不做會讓自己後悔的事，
做了就不要後悔。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 142.179.1.38
推 alulu:你的insert有多長啊 PCR product多長 218.170.156.107 11/06
推 alulu:還有你transformation的DNA比 218.162.110.149 11/07
> --------------------------------------------------------------------------- <作者 oplz (oplz) 看板 Biotech
標題 Re: [問題] about colony pcr
時間 Sun Nov 7 15:04:41 2004
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我的想法 給你參考
你的情況其實不是 PCR doesn't work, 而是在於 inconsistency.
如果要我說 我覺得最有可能出問題的地方在於你在 LB plate 上點完菌後
加入 PCR rxn sol. 的菌量其實每一次都不一樣. 才會造成有時可以 work,
有時不行的情況.
那為甚麼用先放在水裡煮過就沒有問題? 因為這個方法你有用水稀釋你的菌量
所以最後加在 rxn sol. 裡的量其實都不至於會影響反應的進行.
建議你可以用將菌加入 200 ul 水中 打散後再取做 sample 加入 PCR rxn sol.
水煮的動作可以跳過 不會有影響 (或者在 PCR 1st cycle 前加長 94'c 的時間)
相信這樣應該可以解決你的問題.
或者 你可減少取的菌量..你要對 PCR 有信心, 理論上只要有一個 copy ,
PCR 就可以 amplify 出產物, 何況你一沾一定是成千上萬的菌,
更何況做 ligation 的 vector 大多是都是 high-copy number..
ColE1 oriV 在 E.coli 內可以有 200 多個 copy...
只要有 insert, 一定看得見..可以放心. :)
相反地, 加太多菌, 帶入太多菌內的 protein 或其它成分, 反而會影響反應進行.
可以做個實驗, 將超多的菌放在水裡煮過, PCR 可能也會反應不出來的.
另外一點我自己的感想, 跟此文的 case 無關..也無涉這裡的任何人.
分生實驗由於是操作看不見的東西,
往往會不自覺地擔心反應會不會不夠力? 所以不知不覺取或加的量都會多
可能感覺多一點比較保險..其實往往情況不是這樣..
比較好的只是浪費 reagent, 浪費錢, 比較慘的就是該拿到的結果反而拿不到..
舉個大家都應該知道的例子...restriction enzyme..
很多人都怕切不夠力, 就多加一些 enzyme ..事實上這會影響反應的進行,
有時還會造成 star activity. 一般 RE 都用 50% glycerol 儲存,
而 RE 對 glycerol 的容忍限度大概在 5% 以下, 所以這是為甚麼大家都說
RE 不要加到超過總體積十分之一的原因.
有時在 lab 裡面做實驗是舊人帶新人..沒有習慣照紙本 protocol 來.
像 IP 用的 antibody, or protein-A/G beads 這些東西,
第一代跟第二代說加 5ul, 第二代不放心就又多加一些, 結果也出得來..
然後第二代跟第三代講他的 condition 是加 7ul..第三代不知道第一代的 condition
所以又因為不放心再加一些,,,最後就會發現這些量一代比一代加得多..
除了浪費錢外, 還會影響實驗的可信度.
這是題外話, 但大家要對 protocol 有信心一點. :)