為什麼這篇colony pcr中文鄉民發文收入到精華區:因為在colony pcr中文這個討論話題中,有許多相關的文章在討論,這篇最有參考價值!作者smallmin (小明)看板Biotech標題[求救] 請問關於plasmid constru...
小弟我不算分生新手
該知道的基本操作步驟都知道
碩士期間開始接觸plasmid construct
剛開始做初期成功率也有60%
後來當了三年多助理
construct plasmid成了一個很基本的技術
挑的clone成功率90%以上很正常
幾乎沒有重做三次內做不出來的construct
我這一年多來換工作後
construct非常不順利
連TA cloning成功率也很低
常見的狀況是
transform隔天single colony很多 常常破百
可是
用restriction enzyme切 大小總是不符預期
重做5次 挑了50個colony
90%的pattern都一樣
切出來pattern可以再現 但都不對
ex: 我預期切出來是3.1 kb + 1.0 kb
可是切出來90%都是3.5 kb + 0.6 kb
甚至發生總大小比預期大的狀況
ex: 預期plasmid最後是7.3 kb
卻看到7.0 kb + 1.5 kb
定序結果都不對
或者enzyme切出來不對
colony PCR結果 90%的clone band卻正確
可是定序一樣不對
因為我不是新手 碩士畢業 又有三年多實驗室助理經驗
這種基本實驗卻一直失敗
過去一年來construct成功率只有一成左右
可是我同事們都很順利
很少發生重做三次內沒成功的狀況
讓我壓力很大
我跟主管 同事請教過
試過很多方法
https://www.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning
這類troubleshooting的資料也看不少
譬如ligation 加PEG3350 (final concentration 7.5%)
用commercial competent cell, RecA1 (抑制DNA recombination)
http://download.rbcbioscience.com/HIT%20Competent%20Cells/Competent%20Cells/HIT-21/HIT-DM.pdf
我是用HIT-DH5alpha
一年過去了 還是沒什麼改善
進度緩慢 壓力很大
歸納常見狀況
1. 轉型順利 single colony很多 常破百
但enzyme切出來結果不對
2. 我用只有insert上才有 vector沒有的切位
enzyme可以切出band 推測insert有接進去 但大小不對
想請教各位是否可以給我什麼建議
提醒我其他該注意的細節
謝謝
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