1.先在data base上找到目標基因的genomic gene 序列
及
目標基因的mRNA 序列

2.將兩序列儲存至同一個文字文件 ( .txt檔 )


3.利用Bioedit軟體將兩序列開啟

4.執行軟體上方sequence選項內的Pairwise alignment裡的
Align two sequences(optimal GLOBAL alignment) 選項

5.待軟體計算完，即可得到 genomic gene序列
+
已經對齊好的 mRNA序列

Ex:

genomic ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTCCGTAAAGTTAGTTCGATCACACGTCAGCTACGATCTCGTA
mRNA ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTC------------------------------CGATCTCGTA
^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^
(12 mer) (8 mer)

AT: 8 mer
CG: 12 mer CG% = 60 %

primer序列:CTGAGCGATCTCCGATCTCG


6.primer設計技巧

設計此primer是為了要避免掉genomic DNA的干擾

Taq在合成PCR產物時靠的是primer 3'端是否有黏接完全，
換句話說~3'端若是沒有黏接DNA template即無法合成出產物
因此 在設計primer時，可採用5'端序列長度較長(約10~14個mer)
3'端序列較短(約8~10個mer)，而本人習慣設計高GC比(約55~65%間)
因這樣annealing溫度可以提高，增加primer專一性，且可以排除那
些3'端黏合在模板上的機率。另外，需注意primer設計時序列會不會
自行黏合，也盡量避免設計到迴文序列，基本上這樣的primer專一性
都會很高。

另外補充 1.AT在計算Tm值時 皆算2度
CG 4度
所得的溫度減5度，即可當做抓最適條件時annealing的溫度

2.設計Antisense時，請記得將該序列反轉並倒寫

正常序列 Ex.CTGAGCGATCTCCGATCTCG
反轉+倒寫 CGAGATCGGAGATCGCTCAG

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因本身是非生技本科系學生，一路走來真的很辛苦，也碰到很多挫折
因此，提供一些基本知識來讓像我一樣背景的同學能夠讓實驗快速上手
祝大家早日脫離苦海吧!!


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