為什麼這篇點突變Primer設計鄉民發文收入到精華區：因為在點突變Primer設計這個討論話題中，有許多相關的文章在討論，這篇最有參考價值！作者nhxcyge (人生就像個不可逆反應)看板Biotech標題[求救] site-directe...
我現在是做A基因的點突變，
用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
心想應該行不通
F1----------> F2--------->
------------------------------------------------------
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
R1<---------
R2<----------
二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
--
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◆ From: 140.114.202.163
推 icome:跑膠再純會loss非常多 我都直接transform很少失敗 11/11 20:40
→ icome:成功率跟enzyme和competent cll品質有很大關係 11/11 20:42
推 anchi35:有做過1.3Kb+200bp的 也是類似的情形所以用vector的序列 11/11 20:48
→ anchi35:來做PCR 之後再重新接回 11/11 20:50
anchi35大，你是說把primer設計到vector中，離A基因的3'end有一段距離也可以囉？→ blence:只要reaction及DpnI切完後,跑膠看得到隱約的band就會成功 11/11 20:51
→ blence:不須要purify或concentrate,因此5~10ul reaction是夠用的 11/11 20:55
blence大，你說的我做過，不過沒成功QQ 還是要多做幾次transform看能不能賽到一次XD※ 編輯: nhxcyge 來自: 140.114.202.163 (11/11 21:24)
推 dodomilk:你是嫩嫩...？ 11/11 22:55
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作者: tutj (人生若只初相見) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis
時間: Sat Nov 12 14:45:20 2011
※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: 我現在是做A基因的點突變，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
complement primer應該是stratagene QuikChange的方法吧？
: 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: 心想應該行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
你的Tm值是照說明書的公式算的嗎？
我有找到一個網站可以幫忙算
http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html
如果你是照公式算, 說明書要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低
這方法Tm值一定要夠高。因為primer完全complement, 還有突變的base
所以primer間的Tm值會比primer對DNA template的Tm值高
如果一開始設計的Tm不夠高
PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template
至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper
裡面說QuikChange有幾個缺點。 一是上面提的易形成primer dimer
二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。
因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick
一對primer又是完全complement
整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template
那篇paper發明了一種新方法
F1 ---------m----------->
------------------*----------------------------------- *: nick
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation
-----------------------------------*------------------
R1<-----------------m------
如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間
3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick
所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction
故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率
paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供
根據我整理的protocol
這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp
設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃
PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair,
2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM)
3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul
PCR program:
1. 95℃ 5 min x1 cycle
2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles)
Tm no-5℃ 1 min
72℃ 1 kp/2 min
3. 95℃ 1 min x1 cycle
Tm pp-5℃ 1 min
72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率)
elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃
然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃
所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min
取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band
提供給你參考~
--
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◆ From: 175.181.106.80
→ tutj:An efficient one-step site-directed deletion, insertion, 11/12 15:15
→ tutj:single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol 11/12 15:16
→ tutj:BMC Biotechnology 2008, 8:91 11/12 15:16
推 dodomilk:推新方法，不過我覺得原本的方法就很好用了... 11/12 16:49
→ dodomilk:每次作都能挑到十幾個colonies 11/12 16:50
推 ooooh:這篇超專業 11/12 22:55
推 nhxcyge:推! 我原本的primer再出不來就用你這方法試試 11/14 11:55
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作者: blence ( ) 站內: Biotech
標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis
時間: Sun Nov 13 00:23:39 2011
補充一下
QuickChange是可以同時做多點突變，甚至做1kb以上大片段deletion的
不過我同意將原本protocol改成用partial complement primer效率會更好
只不過我的經驗是primer至少要有18~20bp以上的complement
幾次complement太短(嘗試<15bp)反而都失敗
因此如果只是1~2bp的mutation，primer大概25bp都ok
也就是
(3bp)( 20bp )(3bp)
Forward: -----M------------>
Reverse: <---------M--------
primer太長，Tm就會偏高，短一點的話，GC高的部分會比較好做
如果再搭配plasmid 50ng
對於1~2bp極短片段的突變幾乎用55度萬用Tm應該不成問題
: PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template
: 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper
: 裡面說QuikChange有幾個缺點。 一是上面提的易形成primer dimer
: 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。
: 因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick
: 一對primer又是完全complement
: 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template
: 那篇paper發明了一種新方法
: F1 ---------m----------->
: ------------------*----------------------------------- *: nick
: |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| m: mutation
: -----------------------------------*------------------
: R1<-----------------m------
: 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間
: 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick
: 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction
我想新生成的含m的DNA應該是不能當成template的
否則最後的產物會是一堆兩端都含有m的blunt end product
（primer已經有m了，新生成的也有m）
也就是
(F1 primer) ( R1 novel synthesis )
-----m-----------------------------------m---->
以及 ( F1 novel synthesis ) (R1 primer)
<-----m-----------------------------------m----
: 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率
: paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供
: 根據我整理的protocol
: 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp
: 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃
: PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair,
: 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM)
: 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul
: PCR program:
: 1. 95℃ 5 min x1 cycle
: 2. 95℃ 1 min (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles)
: Tm no-5℃ 1 min
: 72℃ 1 kp/2 min
: 3. 95℃ 1 min x1 cycle
: Tm pp-5℃ 1 min
: 72℃ 30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率)
: elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃
: 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃
: 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min
: 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band
: 提供給你參考~
我認識的大多跑10~25ul reaction
因此都是用3~5ul check
另外一些method paper提過extension 68度會比72度有降低突變的機率
不過缺點是amphify效率差
product不用多，一般EtBr的limitation約10ng左右
只要ErBr看得到，那失敗的探討就可能不是QuickChange的過程
※ 編輯: blence 來自: 140.109.40.29 (11/13 17:00)
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aggaci (台南工作的基隆人) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis
時間: Wed Nov 16 18:11:23 2011
※ 引述《aggaci (台南工作的基隆人)》之銘言：
※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: 我現在是做A基因的點突變，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
: 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: 心想應該行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
我的方法不一樣 提供給大家
我的是
P---------m----------->
------------------------------------------------------ m:mutation
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<---------------P
這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做
要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate
因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation......
效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多
另外我用的是fynzyme的phusion pfu
這pfu超好用 作的 超準 超快 超多
--
單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。
--
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◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
推 Ianthegood:推phusion 超貴超好用 11/16 00:35
→ dodomilk:這方法聽起來不錯！ 照你這樣講的話，primer不事先加P應 11/16 01:01
→ dodomilk:該也是可以的，只是之後要多一道PNK的步驟 11/16 01:01
→ aggaci:對阿 要多磷酸化這一步 11/16 01:11
推 micocat:有重疊的好處是不用ligation,pcr完就可以transform了 11/16 01:34
→ micocat:不重疊的話 就是blunt end ligation囉 11/16 01:35
推 mattmatt:phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多 11/16 10:14
推 dodomilk:blunt end self ligation超好作的，不可能會失敗... 11/16 11:30
→ aggaci:真的 但不管怎樣 肯定比TWO-STEP pcr好做很多 11/16 11:52
推 silverberry:想請問樓上們，把 plasmid 做一圈出來的方法， 11/16 15:01
→ silverberry:要怎麼確定沒有不小心錯在 plasmid 上? 11/16 15:01
→ silverberry:我們實驗室都很怕死的做 2 step PCR 11/16 15:02
→ silverberry:雖然速度沒有慢很多，但是還是很多步驟。 11/16 15:02
簡單阿
我們lab的做法是 insert 沒錯就好
之後把insert 切下來再接到新的vector上
2 step pcr難用又難做
→ silverberry: 請大家給點建議~~~ 謝謝^^ 11/16 15:03
推 dodomilk:用pfu 11/16 17:30
PFU還是無法保証vector sequence有沒出錯
除非你去對整個vector定序
所以最安全的做法是 把insert 切下來再接到新的vector上
--
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◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/16 18:12)
→ lovesteve:我的作法是PCR產物處理DpnI後 產物+PNK+Ligase 在16度2h 11/16 19:12
→ lovesteve:效果也不錯! 11/16 19:13
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: aggaci (台南工作的基隆人) 看板: Biotech
標題: Re: [求救] site-directed mutagenesis
時間: Tue Nov 15 23:41:15 2011
※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: 我現在是做A基因的點突變，
: 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
: 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: 心想應該行不通
: F1----------> F2--------->
: ------------------------------------------------------
: ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: ------------------------------------------------------
: R1<---------
: R2<----------
: 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
我的方法不一樣 提供給大家
我的是
P---------m----------->
------------------------------------------------------ m:mutation
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
------------------------------------------------------
<---------------P
這樣做PCR 因為沒重疊所以不太會形成primer dimer 會比較好做
要注意的地方在於我的primer尾端會加phosphate
因為這樣做出來是linear DNA所以之後拿去作ligation......
效率不錯!!我覺得比傳統quickchange好做很多
另外我用的是fynzyme的phusion pfu
這pfu超好用 作的 超準 超快 超多
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◆ From: 140.116.253.121
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:41)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:42)
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.121 (11/15 23:43)
推 Ianthegood:推phusion 超貴超好用 11/16 00:35
→ dodomilk:這方法聽起來不錯！ 照你這樣講的話，primer不事先加P應 11/16 01:01
→ dodomilk:該也是可以的，只是之後要多一道PNK的步驟 11/16 01:01
→ aggaci:對阿 要多磷酸化這一步 11/16 01:11
推 micocat:有重疊的好處是不用ligation,pcr完就可以transform了 11/16 01:34
→ micocat:不重疊的話 就是blunt end ligation囉 11/16 01:35
推 mattmatt:phusion+1 上面+1..不用ligation省事很多 11/16 10:14
推 dodomilk:blunt end self ligation超好作的，不可能會失敗... 11/16 11:30
→ aggaci:真的 但不管怎樣 肯定比TWO-STEP pcr好做很多 11/16 11:52
推 silverberry:想請問樓上們，把 plasmid 做一圈出來的方法， 11/16 15:01
→ silverberry:要怎麼確定沒有不小心錯在 plasmid 上? 11/16 15:01
→ silverberry:我們實驗室都很怕死的做 2 step PCR 11/16 15:02
→ silverberry:雖然速度沒有慢很多，但是還是很多步驟。 11/16 15:02
→ silverberry: 請大家給點建議~~~ 謝謝^^ 11/16 15:03
推 dodomilk:用pfu 11/16 17:30
推 silverberry:但是就算用 pfu 或是 phusion 也不能保證完全不會有 11/17 11:38
→ silverberry:mutation吧? 我不知道要怎麼說服老師^^" 11/17 11:39
→ aggaci:樓上請看我下一篇 11/17 11:41