為什麼這篇primer稀釋鄉民發文收入到精華區：因為在primer稀釋這個討論話題中，有許多相關的文章在討論，這篇最有參考價值！作者jkq (玩具)看板Biotech標題[求救] 我的PCR primer 是不是有問題時間Wed...
目前為了找出白蝦裡的血藍素
採了組織 抽了RNA 翻了cDNA
但到了我們要利用設計好的primer 去夾
卻始終夾不出來 連用梯度去跑 也沒東西
想請問看看 是我們的primer有問題 還是哪裡出了問題
這是白蝦的血藍素序列 cDNA 濃度則是4.9 ug/ul
http://ppt.cc/tvMU
而我們設計了兩組primer 加上切位 CCCGGG和CTGCAG
F-5'-AT CCC GGG G AAATGGGAATTTTCAGAATG-3'
R-5'-AT CTG CAG TGCATATGTTCTTTATTGTGG -3
F-5'-AT CCC GGG C ATGAAATGGGAATTTTCAGA -3
R-5'-AT CTG CAG AAACAATTCATTCATCGACA -3
配法
cDNA 1
PCR buffer 1
2.5 mM dNTP 1
1/5x 稀釋 Primers 0.2
Taq DNA polymerase 0.1
ddH_2O 6.7
total 10
這是我們的梯度PCR program
Stage1 Stage2(35cycles) Stage3
95℃ 94℃ 55~65℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30 sec 1 min 2 min 10 min Hold
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◆ From: 210.59.89.34
※ 編輯: jkq 來自: 210.59.89.34 (07/18 09:36)
※ 編輯: jkq 來自: 210.59.89.34 (07/18 09:44)
→ skybreeze:要不要先找一組一定夾得出東西的primer看看sample有無 07/18 13:02
→ skybreeze:問題 07/18 13:02
推 sunnyforever:可能cDNA濃度太高吧 再稀釋看看 07/18 13:08
→ jihyang:我拿你的序列去比對 怎麼都沒對應到? 可以說一下 從哪裡 07/18 13:13
→ jihyang:開始嗎? 07/18 13:13
→ jihyang:另一方面，RNA抽出來的品質 還ok嗎? 07/18 13:15
→ jkq:序列不是從CDS開始 而是從在前面一點的mRNA序列開始 07/18 13:24
→ jkq:因為試過直接從序列開始和結束處 直接設計 但GC值會太高 07/18 13:25
→ jkq:另外切位後面多加的C或G 只是為了上他接上vector的時候 07/18 13:26
→ jkq:能呈現三字組 07/18 13:27
→ Ianthegood:cDNA先稀釋個一百倍吧 體積不同有時候結果也會不一樣 07/18 14:18
→ Ianthegood:然後gradient可以從50開始拉吧 07/18 14:19
→ blence:看到這個cDNA濃度，應該是RT完之後拿去測的吧... 07/18 15:52
→ handolu:cDNA濃度要再稀釋個10倍吧，序列找不到+1 07/18 17:11
→ jkq:請問pcr濃度多少才適合呢 07/18 18:28
→ jkq:序列為AAATGGGAATTTTCAGAATG 07/18 19:57
→ jkq:切位後 就是序列 但不是設計在血藍素本身 07/18 19:59
→ RickyKckao:一般50uL的PCR我都取1~2ug的template來P 07/21 02:12