講一下我的經驗好了
之前做過就有在做primer design的工作
最近也正好再接觸Real time PCR 的部分

一般的primer design注意兩件事情
1.序列盡量保持亂數，ATCG通通都成亂數排列
2.CG%要控制好，盡量CG:AT=1:1

當然如果是clone等狀況就另當別論..........


而在 Realtime 部分
我目前用的是ABI的機器 SYBR Green的系統
primer design的部分我交給primer expression去設計
在我所選定的特定範圍中做（等等詳述）

只要是用ABI的機器，理論上都有『primer expressoin』這套軟體可用
如果是Roche 的話我就不熟了.......

以下是軟體的部分設定值
Tm值設在58~60℃(原廠設定)
product size 50-150 bp(原廠設定) 之前問廠商最多可以到250bp
CG% 30%-80%(原廠設定) 不過考慮二級結構和Tm等問題我設定在30%-50%最多60%
primer length 個人習慣設定在 20bp上下...不超過30bp
primer 3' GC不要超過2 bp (原廠設定) 最好也都不要有CG
G repeats 不要超過3 bp

Probe部分不寫....


另外SYBR Green部分要特別注意Dimer 的問題
所以一對primer設計出來後要特別去注意一下
對本身和對另一條primer有無dimer的產生...

最後........
序列選擇上...只要是許可狀況下
我都會選擇有跨過junation的部分來設計
這樣可以避免gemone DNA 的干擾......

以上...大概是這樣
※ 引述《phine (this is me)》之銘言：
: 大家好呦
: 最近想要找幾種基因跑 Q-PCR
: 打算從NCBI找SEQUENCE
: 用PRIMER 3 來設計
: 請問一下在用PRIMER 3 設計的時候
: 大家會考慮到什麼參數呢
: 我目前只有對Tm 和PRODUCT SIZE有所限制
: （我是用syber green系統）
: 另外
: 為配合其他基因一起跑
: 目前同一盤設定的溫度為
: annealing temp 60度
: elogation temp 72度
: 請問這樣大家會建議
: PRIMER的Tm多少比較好跑呢
: 最後一個問題就是
: 我之前請明欣合成PRIMER
: 他合出來的Tm跟我當初設計的差很多
: （低了二十度 70變50）
: 我反應後
: 他的理由是每種程式計算TM的方法有差
: 但是會差到那麼多嗎？？
: 這樣我的 annealing temp也不知道從哪裡測試了 ︿︿；
: 有人有碰到跟我一樣的問題嗎
: 挖真是有點落落長
: 感謝大家的耐心歐
: 希望大家新年快樂呦

--

夜生活不只是一種生活，更是一種態度，音樂有很多類型，夜店有很多種類
喜歡與否只是一種偏好，卻不代表全部的選擇，夜生活的多樣與多變應該是
讓人有更多更廣的眼光看生活與體驗.........

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 123.192.165.194