為什麼這篇勝任細胞意思鄉民發文收入到精華區：因為在勝任細胞意思這個討論話題中，有許多相關的文章在討論，這篇最有參考價值！作者a14743535 (pig)看板Biotech標題[求救] transform時間Sun Ap...
請問一下版上的各位先進
我們家的competent cell是跟廠商買的不是自己做的
我在做的時候會習慣將一管100ul competent cell分成五管來進行
也就是這五管分別加入不同molar ratio的ligation product
但都沒有長出任何的colony
在想是不是要改一成一管100 ul competent cell一個molar ratio
我想請問competent cell的量是否會有影響呢？
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◆ From: 124.11.132.89
→ lask:當然有，但是跟ligation product也有關 04/14 21:17
→ a14743535:ligation的部份有跟老師討論研究過了~應該是沒有問題 04/14 21:26
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.132.89 (04/14 21:27)→ blence:我以為分很多管是常態,通常這樣做不出來會是其他問題 04/14 22:22
→ a14743535:我也以為是常態XD 04/14 23:01
說一下目前的情況
insert(900bp)成功接進yT&A當中
用兩個限制酶(Xba I，Cla I)將insert切下再接入另外一個vector(pBK-CMV-Gal4)中
vector的部份是先以Cla I作用兩小時，跑膠確認有沒有切乾淨
再以Xba I作用兩小時，切膠純化
進行ligation，molar ratio 1:2 ~ 6
4度C overnight，70度C中止反應(ligation product有跑膠，出現DNA ladder
老師說這樣是有發生ligation)
進行transform
用HIT competent cell(100uL/tube)
以tap water解凍至1/3融解
分裝成五管，每管20uL
取小於等於competent cell體積10%的ligation product(2uL)加入competent cell
vortex 1s
冰上反應5分鐘
塗盤，37度C培養overnight
隔天就什麼也沒看到...而且我還有做一管是完整的plasmid去進行transform
結果也什麼都沒長...
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/14 23:25)
→ blence:pBK-CMV是Kan吧,HIT,YB這些快速transform的遇到Kan最好能找 04/14 23:42
→ blence:照以前revovey放置30min比較好,而且Kan也盡量25ug/ml以下 04/14 23:43
→ joey0715:ladder的位置正確嗎 gel底部能否看到insert 04/14 23:52
→ joey0715:另外冰上反應有敲嗎，建議反應完做一下recovery 04/14 23:56
→ a14743535:@blence我Kan是用25ug/mL，謝謝建議 04/15 00:00
→ a14743535:@joey0715 少打一個XD，冰上反應前有vortex 1s 04/15 00:01
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/15 00:01)→ huuban:我們養DH5a會有42度45秒的步驟再冰上1分..不會直接塗盤耶@@ 04/15 00:02
→ a14743535:我是都照廠商給的protocol 04/15 00:04
→ a14743535:ladder的位置有沒有正確我不知道@@，接起來也不是環狀 04/15 00:05
→ a14743535:所以我不知道怎麼看...但insert是看不到的 04/15 00:05
推 ithinksoiam:不然試試看培養液 recovery 1hr 後再塗盤勒 04/15 08:40
→ a14743535:想請問一下recovery的時候要不要shaking 04/15 13:19
→ joey0715:circular的話會在total大小上下共有3個band 04/15 13:24
→ joey0715:有check marker是否跑掉嗎，recovery大約1ml就夠塗前濃縮 04/15 13:29
→ a14743535:在那附近有好多band... 04/16 09:39
這次多加了個recovery 30min的步驟control組(完整的vector)有長出來了
長滿滿的
可是實驗組卻還是一顆都沒有長...
好難過...
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.120 (04/16 09:41)
→ kunhan1013:42度 heat shock? 04/16 10:34
廠商protocol上沒說要heat shock還是我要多加這一步？
→ huuban:膠圖拿出來大家討論吧 04/16 10:37
http://photo.xuite.net/a14743535/6260888/1.jpg
vector是4700bp insert約850bp
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 11:24)
推 a90648:多做個heat shock試試看? 04/16 11:24
→ a90648:vector only切完有那麼多條，是原本有接東西在裡面? 04/16 11:29
我的vector上面原本就已經有個Gal 4接上去vector only是在做ligation的時候DNA只加經過double RE digest的vector不含insert
然後這個vector是用切膠純化下來的
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 11:47)
→ huuban:沒碰過會ladder的，也沒碰過接不是環狀的@@ 04/16 13:24
→ huuban:怎麼確定有接上的呢？ 04/16 13:30
→ blence:為什麼vector only經過XbaI跟ClaI切過會有這麼多band？是切 04/16 13:56
→ blence:膠完純化後才跑膠嗎？ 04/16 13:57
我也不知道為什麼會有這麼多band@@我是將vector先以Cla I切再以Xba I切之後跑膠純化
再將純化出來的取一點出來
加入buffer A 1
buffer B 1
vector 3
ddH20 4
ligase 1
---------------------
total 10uL
再跑膠後就變那個樣子了
→ blence:你們老師說的ligation product有出現ladder才算lgation發生 04/16 14:00
→ blence:這句話問題很大,一般transform會成功的用量,跑膠根本看不到 04/16 14:03
→ blence:他可能指是製造特殊nt的plasmid從linear接成ccc的評估方式 04/16 14:06
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/16 14:27)推 puec2:為什麼有兩個 buffer? 04/16 17:01
推 chaunen:益生的bufferB是用來增加blunt end 的ligation效率. 04/16 19:21
→ chaunen:addgene的database中pBK-CMV上有兩個ClaI site. 04/16 19:38
推 chaunen:建議:1. 分別用xbaI ClaI 做single cutting 然後跑膠 04/16 19:43
→ chaunen:和uncut 相比, 應該只剩1條4.7kb的band. 04/16 19:46
→ chaunen:表示plasmid上應該只有 "1個"XbaI or ClaI site 04/16 19:47
→ chaunen:並且這2種RE enzyme還是好的, 不用買新的. 04/16 19:48
→ chaunen:而inser可以從TA clone上切下, 表示這兩個cutting site 04/16 19:51
→ chaunen:也是OK的. 到此, inser & vector製備應該是沒問題的. 04/16 19:53
這裡建議的部份，都已經有做過了，沒什麼問題。→ chaunen:2. ligation 時的bufferB可以不用加. 04/16 19:57
→ chaunen:3. ligation product通常比plasmid還難transform (難很多) 04/16 20:00
→ chaunen:ligation product和competent cell增加,ex: 40ul to 100ul 04/16 20:14
→ chaunen:heat shock 後可加 SOC medium recovery, 增加efficiency 04/16 20:16
這邊因為廠商的protocol沒說要heat shock所以大大的意思是要我自己多加個heat shock的步驟嗎？
→ chaunen:plate就多塗幾盤. 04/16 20:17
→ chaunen:補充 益生YB ligase RT(22-25) 1-2hr就OK了 04/16 20:18
→ chaunen:ligation完最好能跑PCR check, primer設計需跨inser or 04/16 20:21
→ chaunen:一條primer在inser上, 另一條在vector上(跨cutting site) 04/16 20:22
→ chaunen:避免偽陽性. 04/16 20:22
→ chaunen:pBK-CMV上可以使用M13 forward, reverse primers來完成 04/16 20:23
→ a14743535:請一下SOC medium可以改用LB嗎？因為我們家沒有SOC 04/16 20:24
推 chaunen:SOC可以自己配阿XD" 04/16 20:27
推 chaunen:tryptone 2g; yeast extract 0.5g; NaCl 0.05g;KCl 0.019g 04/16 20:31
→ chaunen:pH調到7.0 滅菌後冷卻,再加 2ml 1M glucose(sterile) 04/16 20:33
→ chaunen:我覺得先check vector plasmid比較重要@_@ 04/16 20:34
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/16 21:38)推 chaunen:我覺得加heat shock比較好, 42度C 45s, on ice 10mins, 04/16 22:10
→ chaunen:加5X體積的SOC medium 37度 shack 1hr(recovery) 04/16 22:10
→ chaunen:我用過益生的ECOS DH5a 是OK的. 04/16 22:11
→ chaunen:vector cutting時, 若切下的片段<50mer 不用切膠純化 04/16 22:13
→ chaunen:直接clean up 即可. 04/16 22:14
想請問一下這裡是會有什麼影響嗎？→ chaunen:不過transform時需做vector only (no ligation)的control 04/16 22:15
→ chaunen:當然vector only 的 ligation 也要做. 04/16 22:16
這裡我都有做※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.136.149 (04/16 22:33)
推 chaunen:個人覺得經過切膠純化回收率比較低. 04/16 23:19
→ chaunen:一般spin column抓不到~45mer以下的短片段 04/16 23:20
→ a14743535:只是單純回收率的原因就是了XD 04/16 23:21
→ chaunen:是XD" 04/16 23:24
→ chaunen:我覺得要先PCR check ligation product 04/16 23:26
→ chaunen:若沒接進去 transform再多也是白搭XD" 04/16 23:26
→ a14743535:就取個約1uL跑PCR嗎？ 04/16 23:48
→ blence:用PCR check ligation product完全沒必要,buffer condition 04/17 01:06
→ blence:不見得適合taq,而且10^8的效率都沒有,那更沒有PCR出場必要 04/17 01:11
→ blence:HIT是學YB的,原po在transform可以找YB的網頁TM參考,heat sh 04/17 01:15
→ blence:有較眼前方法更佳的效率不妨調整,vector的部分,你的圖根本 04/17 01:17
→ blence:看不出two RE切完後呈現single 4.7k的樣子,或許你有確認？ 04/17 01:20
http://photo.xuite.net/a14743535/6260888/2.jpg
→ blence:上面有提ClaI有兩個site就去翻map,暈倒,你知道切到什麼嗎 04/17 01:36
→ blence:如果你是bcakbon是stratagene的pBK-CMV,上面方法都不用試了 04/17 01:39
怎麼說？※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.139.25 (04/17 01:41)
→ a90648:你手上應該有pBK-CMV-GAL4的map吧!!先看一下ClaI切在哪 04/17 09:22
我只有單純的pBK-CMV的map...ClaI在pBK-CMV上確實有兩個切位是在1036bp跟4028bp的位子上
如果兩個切位都被切到
那應該會有約3000bp跟約1500bp的片段
可是在我只單用ClaI 切的時候
並沒有看到這兩個片段
我也有去查過Gal4的切位
上面都沒有XbaI或ClaI的切位
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 09:53)
→ a90648:那就對啦!!這就是現在怪異的地方，先確定你拿到的vector 04/17 12:01
→ a90648:是不是對的囉!! 04/17 12:01
→ a14743535:是送定序? 04/17 12:41
→ blence:送訂序...新手要先學習MCS沒寫的就不該用,除非你很熟 04/17 13:14
確實是沒很熟@@只是實驗是由學姐設計的
後來才交給我做的...所以有些部份也不是非常清楚
→ blence:而且雙切後的應該4.7k,前面就提了你也沒檢查過這個結果 04/17 13:16
檢查這個結果?這裡我想請問一下該怎麼檢查
因為單切在上面我有再附一張膠圖了
而雙切我是沒有另外再拍下來
大小也是在那個位置附近
→ blence:另外,你的圖若使用快速dye也應該要瞭解有何缺點,問題太多了 04/17 13:19
→ blence:瞭解Gal4在pBK的MCS位置,換新的RE,才是解決方法 04/17 13:23
這個我有了解過了Gal4是接在原本BamHI跟SpeI的地方
沒有影響到我要用的兩個酵素的位置
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 13:43)
推 chaunen:ligation PCR 3個小時就可以知道結果, 1ul的ligation 04/17 13:42
→ chaunen:product對PCR效率並沒太大影響. 04/17 13:43
→ chaunen:如此一來你可以知道到底有沒有ligation成功 04/17 13:44
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 13:46)→ chaunen:如果有,那就是後面transform的問題 04/17 13:44
推 chaunen:ClaI這個酵素會受到dam dcm影響,DNA被甲基化就切不動. 04/17 14:09
→ chaunen:也許位於4028bp的ClaI site是因為DNA被甲基化而切不動 04/17 14:10
→ chaunen:根據原PO的講法, XbaI or ClaI 單切/雙切都是4.7kbp band 04/17 14:11
因為兩個所切下來的片段才20~30bp而已~膠上看不太出來這微小的差異吧※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 14:18)
推 chaunen:ClaI(1036bp) 和XbaI切下來的小片段當然看不到. 04/17 14:24
→ chaunen:重點是ClaI(4028bp)到底是不見了還是甲基化了,因為切不動 04/17 14:26
→ chaunen:所以大家才會覺得vector本身可能就有問題 04/17 14:26
我不知道有什麼方法可以檢查...定序的話
也沒有那個primer可以定到那個區域...
※ 編輯: a14743535 來自: 140.112.79.176 (04/17 14:35)
推 a90648:其實定序用的primer自己設計一個就可以囉 04/17 14:45
→ a90648:沒軟體可用就土法煉鋼的數個20mer，Tm大約算一下就可以了 04/17 14:47
推 chaunen:用NcoI切看看,應該會 700bp, 1.9k, 2.1k 04/17 14:53
推 a90648:不然就是找個dam/dcm-的competent cell retransform 04/17 14:54
→ a90648:vector，抽出來再切切看囉!! 04/17 14:55
→ chaunen:原PO可以用vector NTI做一個自己的map 04/17 14:58
→ chaunen:用addgene上的pBK-CMV 序列加上你們自己塞進去的Gal4 04/17 14:59
→ chaunen:用甚麼酵素切會跑出多大size的band就會一目瞭然 04/17 15:00
推 huuban:推樓上，沒有primer就自己設計一個，一邊在vector 04/18 13:25
→ huuban:一邊在你的基因上，今天訂，明天你就可以PCR囉 :) 04/18 13:25
→ huuban:話說，如果你最後成功了，記得把問題解決方式在整理上來:) 04/18 13:27
最近又試了幾次連ligase都換成新
現在變成連control(uncut vector)都長不出來...
之前明明就有長出來的說
※ 編輯: a14743535 來自: 27.245.228.127 (05/01 10:11)
推 a90648:你可以把最近做的流程再打一篇問會比較好喔!! 05/02 14:21
→ a90648:這篇已經被堆到後面了，比較難被發現 05/02 14:22