※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言：
: ※ 引述《wenwentien (期待雨後的彩虹)》之銘言：
: : 大家好,目前在進行ligation碰到了問題,
: : 請大家幫幫忙
: : 我目前要接的insert約1.6k,而vector是8.4k左右
: : insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone,
: : TA clone sequence結果正確, insert與多加的限制?切位也都有,
: : 之後將insert與vector加入BamH1與Xhol切, 37度, 2.5~3小時~
: : 跑膠結果大小都正確~
: : 經過gel elute之後insert濃度約94ng/micro liter
: : 而vector濃度約18ng/micro liter
: : V:I condition= 1:5, 因此ligation體積是V:I=1 microliter:5 microliter,
: : total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的,
: Hi, 這邊就有問題了喔~~
: 所謂vector:insert = 1:5, 指的是molar ratio=1:5,
: 不是volume=1:5, 依照您的做法算出來的molar ratio已經高達1:262,
: 而且通常vector的濃度至少必須要50ng(100ng would even better),
: 18ng有一點太低了, 就算是high copy number + commercial ligation,
: 要挑到positive construct應該蠻難的吧~

不好意思啊,我這邊沒交代清楚, 我ligation時, vector是94ng(94ng*1 microliter),
insert是90ng(18ng*5miccroliter).所以對應的體積是V:I=1:5,
又由於我vector長度是insert的5倍,所以molar ratio與體積比相同

: : Ligation用兩種方式進行:
: : 在16度裡overnight(a)與4度overnight(b)
: : transform也用兩種方式:
: : 放冰上15min直接塗盤(c)
: : 塗盤之前加入SOC medium, 37度, 1hr後塗盤(d)
: : 因此有a-c,a-d,b-c, b-d四個plate, 但今天結果是一個colony都沒長~
: : 想請教各專家, 我會是在哪個步驟出問題呢?
: : 謝謝各位專家~
: 關於transform, 請問... 您有做heat shock嗎??
: 不好意思, 因為您說冰上15min直接塗盤,
: 我會直接聯想到where is the heat step??
: 在此假設您有做heat shock,
: 在請問您為何要用SOC medium啊???
: 您transform的是不是比較特殊的E. coli strain呢?

我的兩種competent cell都是 DH5-alpha, 很常見的E.coli
(c)的直接塗盤是真的沒有heat shock
(按照protocol的步驟,就只放在冰上,雖然我一開始也很懷疑,但還是決定先follow),
所以alicialai專家認為仍須heat shock比較適合?
(d)的transformation就有heat shock,會用SOC medium是廠商附的,由於之前TA clone
是用這款competent cell,有成功,因此就不疑有他,
所以SOC medium是for特殊的菌種嗎?我改成LB會比較好?

謝謝alicialai專家的指導~

我的做法是transform後加LB進37度shake 1hr再塗盤~
: 目前為止只要不是太龜毛的strain and plasmid,
: (是的敝人目前也正shffer在龜毛的S17 and pDM4.. Orz)
: ligation and transformation沒出過甚麼大問題說~
: 希望有幫助到您喔^________________^
: 有問題在互相討論~

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