各位好，

目前接了一個實驗是設計一個indirect competition ELISA

手上有的東西:

1. human X full-length recombinant protein (欲測蛋白, 非所使用一抗的immunogen)

2. anti-human X mouse monoclonal antibody
(Primary Ab, immunogen為另一來源的full-length X protein, unknown epitope)

3. anti-mouse IgG1 rabbit antibody (Secondary Ab)

4. Human serum sample

5. Human plasma sample

==
||
ELISA策略是：||-X <-1Ab-2Ab*HRP
|| AG->

先將antigen X coating在ELISA用96-well，blocking，

加入待測物AG 與序列稀釋的X (as standards)，

再加入Primary Ab, Secondary Ab, TMB substrate, stop,

Count OD at 450nm by ELISA reader.

如若加入的sample會搶走Primary Ab,

則結合在solid phase的X 就會得到比較少的Primary Ab與後續反應的呈色。

([AG]↑，則 OD↓)


==

實驗設計之初，

我titrate primary Ab 與 coating Ag,

得到這個結果 http://0rz.tw/h1S3k (Excel表單，第一個工作表)，

由此表得知coating Ag在250ng/ml時 OD值 Max-min的range最大，

而Primary Ab則在4000x dilution時 OD值 Max-min的range最大，

所以我初步設定coating Ag = 250ng/ml, primary Ab = 4000x dilution.



接著我使用此condition測不同稀釋倍數的human serum sample，

雖然測試點位不多，但也能明顯看到OD隨著濃度上升而下降

http://0rz.tw/h1S3k (第二個工作表)

未稀釋的plasma組 (OD=0.29) 與未加sample的blank組 (OD=2.24)

OD值差距可以拉到將近2.0;



然而我如果使用序列稀釋的 X recombinant protein當作standards

從濃度 3333ng/ml 兩倍序列稀釋，

http://0rz.tw/h1S3k (第三個工作表)

即使加入最高濃度standard, OD值仍然有1.62之高，降不太下來，

與沒有加的blank組 (OD=2.24) 比較起來只相差0.6不到...

而低濃度standard的組別，也幾乎就在2.1上下徘徊，

與blank組也相差無幾，等於可測得濃度的sample range相當小，

運用在不同來源的sample時會窒礙難行。



我下一步可能會把standard的最高濃度再上調，

試試看是否能夠畫出range比較大的curve,

只是相對於其他commercial ELISA kit的standard大多落在 1000pg/ml~100ng/ml,

我所設定的standard濃度已經算是相當高，

再濃下去 我的recombinant protein用量與開銷就得突破天際了...

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基於以上遇到的狀況，

有幾個問題想請教大家：

1. 除了繼續加大standard用量以外，我應該如何調整實驗condition,
才能把standard濃度拉低 curve仍能維持呢？


2. 這樣的問題是由於standard對coating Ag的競爭性太弱所導致嗎？

可是兩者我都是使用同一種recombinant protein去作，
對打濃度也達到3333ng/ml vs 250ng/ml了，
怎麼3333ng/ml 搶primary Ab 還是搶不過 250ng/ml的呢？


3. 另外有一種有別於competition ELISA的 inhibition ELISA,
是把protein先與primary antibody incubate之後，
再加入well與coating Ag反應呈色，
但我不大了解這樣做的原因，所測的目標是coated protein嗎？



以上，謝謝看完繁雜的文章，

有任何看不懂的地方也請告知，我會再作更仔細的說明，

感激。


台灣隊十二強加油！



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