為什麼這篇定序結果怎麼看鄉民發文收入到精華區：因為在定序結果怎麼看這個討論話題中，有許多相關的文章在討論，這篇最有參考價值！作者solom (花的姿態)看板Biotech標題Re: [問題] 定序問題與分析序列問題時間Sun...
定序結果怎麼看 在 凱莉給點力 Instagram 的最佳貼文
2021-09-03 11:44:39
成為一個禮拜只出門一到兩次的防疫小尖兵已經一個多月了 這段時間開始畫數字油畫、看了好幾本小說、追了幾部新劇(我的上流世界今晚要完結了😍) 還聽完了台大歐麗娟教授講紅樓夢的線上開放課程(順手送上連結：http://ocw.aca.ntu.edu.tw/ntu-ocw/ocw/cou/101S120/4...
※ 引述《yaliu (雅)》之銘言：
: ※ 引述《captdavince (走自己的路)》之銘言：
: : 各位好
: : 不好意思..
: : 是一個課業上的問題..但是是星期五結束的討論.很想要知道各位是怎麼做的
: : 還請各位包涵
: : 我們拿到一張sequence定序的圖.還有wild type的sequence，應該是patient的sample
: : 然後是已知有問題的sequence，然後就是要我們找到位置.。然後看混淆的sequence
: : 定序區，然後identify是那一種mutation
: : 定序用的方法應該是sangers sequencing
: : 主要就是混淆的sequence中眼睛看確認那個地方是什麼polymorphism然後再比對
: : 1.請問一下..如果我這樣做，我怎麼知道那個mutant是從那一股的DNA定到的?
: : 當時實驗課很趕，所以我只稍微問了一下助教，助教是說一跟wild type比就知道
: : 我實際用DNAMAN比一比是把跟wild type比較像的放到同一股上
: : 但是這樣不是會有一個問題：在不知道是什麼mutation, inversion, deletion,
: : insertion的情況下，怎麼知道定序上兩個peak代表的nucleotide是在那一股上?
我解釋一下
定序的圖為leukemia病人的cancer cell DNA進行PCR後
未經過cloning直接做定序的結果
你所拿到的應是屬於single allele mutation(heterozygous)的情形
因此定序結果會看到從mutation site開始, 後面的序列都會有兩個顏色的peak重疊的情形
其中一個代表wild allele, 另一個代表mutant allele
但是因為不知道重疊的兩個peak哪一個是屬於wild allele, 哪一個是mutant allele
所以要根據發給你的wild sequence, 去找出屬於wild allele的訊號
這樣剩下的另一種就是mutant allele的訊號了
: : 2.在看sequence時，大家都是全部輸進電腦裡做multiple alignment然後看嗎?
: : 還是說都用眼睛看呢?
如果是經過cloning後定序的結果, 或是確定只有一種PCR amplicon(or sequence)的結果
才適合用電腦做alignment (定序結果通常會另外附上.txt檔)
像這次的題目是不適合的
: : 3.一些mutation像是deletion, addition或site mutation可以在multiple alignment
: : 後看得出來，但是像是inversion, frameshift等mutation
: : 有algorithm可以看得出來嗎?
:
: 基本上定序完後，廠商會給兩個檔案
:
: 一個是看訊號的強度，一個是訂完的nucleotide序列
:
: 我們通常都是將序列輸入倒NCBI進行blast就可以知道
:
: 你比對到的相似物種序列，以及方向
:
:
: 當然如果你已知序列的功能或來自的物種，並且有WT的序列
:
: 只想知道這兩個序列差異
:
: 也可以利用NCBI上面的bl2seq比對一下就可以知道了
:
: 什麼樣子的突變就可以知道了，用肉眼看太困難了
:
: : 4.另外一個有關定序的問題想要問一下，在爬文之後發現就是一般要定序都會做TA
: : cloning
: : 像這種時候送定序就直接送嗎?不需要給廠商vector的種類跟做cloning用的切位嗎?
:
: 送定序看你送什麼樣子的樣本
:
: 可以送菌（必須告訴廠商host及抗生素抗性、質體）
:
: 也可以送質體（當然要講是哪種質體）
:
: 切位不用講
:
: : 好像有些情況也是PCR product確定是single band後也可以定序
: : 像這兩種，如果廠商不需要vector的種類，或只是PCR product
: : 要怎麼選primer呢?如何才能定到?
:
: 也可以送PCR產物（要確定是single band），不需講vector種類
:
:
: 送定序除了給sample之外，最重要的是要說以什麼primer定序
:
: 如果是廠商有的primer不用附給他們
:
: 但如果是自己合成的primer就必須附給廠商
:
: 並且告知廠商primer濃度及黏合溫度
:
: primer就送你PCR用的primer即可
以上y大說的沒錯..感謝補充～
: : 謝謝各位
如果還有問題歡迎一起討論～
PS. 我是助教 XD
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推 conective:XDDDDDDDDDD 06/07 19:36
推 sharkzoe:助教好 XD 06/09 09:47
推 captdavince:大概了解了XDD...應該算是有對到了.謝謝.直接用看的:) 06/09 18:40